懂得：试剂盒及其用途的制作方法2023/7/25 2:32:37

2023-7-25 02:32| 发布者: 天若有情| 查看: 120| 评论: 0

摘要: 　　本发明涉及生物医学领域，具体的，涉及试剂盒及其用途，更具体的，本发明涉及一种试剂盒、试剂盒的用途、一种构建目标区域测序文库的方法、一种测序方法、一种检测目标区域变异的方法和装置。Ｊ凳├?1、样本选择 ...

　　本发明涉及生物医学领域，具体的，涉及试剂盒及其用途，更具体的，本发明涉及一种试剂盒、试剂盒的用途、一种构建目标区域测序文库的方法、一种测序方法、一种检测目标区域变异的方法和装置。Ｊ凳├?1、样本选择与dna提取。在本发明的实施例中选择1个带有已知突变tp53基因i195f突变的福尔马林固定石蜡包埋(ffpe)的胃癌组织样本，具体样本信息见表3。表3样本编号组织类型来源突变位点获得途径sc1ffpe低分化胃腺癌患者tp53-i195f临床样本sc1样本所带的tp53基因i195f突变经过sanger测序验证，测序峰图见图4。采用dneasyblood&tissuekit基因组提取试剂盒(qiagen，货号：69504)提取其中的基因组dna。利用qubit2.0荧光分光光度计(lifetechnologies，货号：q32866)检测提取所获得的dna浓度。2、基因组dna片段化样品打断采用ab公司的covarissystem可将样品dna片段控制在100～500bp范围。样品打断结束后，取少量(约总量的1/30)打断后样品在2％琼脂糖凝胶上进行1*tae电泳检测，并保存好胶图。打断效果一般以所要求制备的文库片段大小在所打断dnasmea的主带位置较为理想。例如，若要求制备插入100bp的pairedend文库，则打断后dnasmear主带在100bp处即可，若打断效果不理想则需要进行重新打断。样品片段化步骤也可使用其他打断系统，具体参数可根据仪器的要求进行调整。covarissystem打断具体操作为：1)每天使用前须更换covariss2仪器有机玻璃水槽中的水，水面须达到“waterline”的界线。使用的水须是milli-q的水或超纯水，每天仪器使用完毕后需将水槽中的水及时倒掉，每个月须用超纯水清理有机玻璃水槽至少一次。2)开启covaris专用的笔记本电脑，检查其与各仪器终端是否连接。打开covariss2仪器和制冷仪开关并检查制冷仪的温度设置是否为4℃。3)双击打开covaris主程序“sonolabs-seriesv2.54”后点击“start[enter">”，待仪器排气30min，且水温降为10℃左右后方可使用。打开主程序之前须先确定打碎仪和冷却仪的电源开关是否打开，否则主程序会提示错误并重试。4)将样品加入待用的100μl的covarismicrotube中，样品加入量5μg，最后将终体积用te补至100μl，用移液器将样品溶液吹打混匀。点击“configure”，按下表设置参数：选择模式为“frequencysweeping”。所有设置完成后点击“save”或“saveas...”保存好程序，再点击“returntomainpanel”回到主界面。将打断管放入covaris装置中，选择好程序，开始打碎。按所设置的程序打碎完成后便可以进行下一个样品的打碎，若无其他样品须打碎可以关闭打碎仪和制冷仪的电源然后关闭打碎主程序和电脑。5)将打断后的样品从玻璃管中吸出，放入1.5mlep管中。取出3μl的样品用于2％琼脂糖凝胶进行1*tae电泳检测，并用1.8倍beckmancoulter公司的agencourtampurexp磁珠(a63881)进行回收，产物溶于32μl的elutionbuffer(eb)中。3、末端修复预先从-20℃保存的试剂盒中取出10xpolynucleotidekinasebuffer和10mmdntpsmix，将其置于冰上融解并充分混匀10xpolynucleotidekinasebuffer。在1.5ml的离心管中配制末100μl端修复反应体系：30μl的片段化回收产物、12μl超纯水、5μl10xpolynucleotidekinasebuffer(b904)、0.4μldntpsolutionset(自己稀释混合为25mmeach)、1.2μlt4dnapolymerase、0.2μlklenowfragment与1.2μlt4polynucleotidekinase。20℃ 温浴30min后，用1.8倍agencourtampurexp磁珠回收纯化反应体系中的dna，产物dna溶于33.5μl的eb中。4、primeradapter连接1)在产物离心管中按照如下体系配制接头连接反应体系，充分混匀后轻微离心；试剂体积(μl)dna31.52×ligationbuffer37.5p1_adapters(10um,自合成)1.5a_adapters(10um,自合成)1.5dnaligase3totalvolume752)将离心管放置在thermomixer中20℃孵育30min；3)用1.5×体积agencourtampurebeads纯化反应产物，最后用52μlelutionbuffer回溶产物；4)用1.5×体积agencourtampurebeads纯化第一次纯化的回溶产物，最后用33μlelutionbuffer回溶产物；5)用qubit2.0检测接头连接之后的产物浓度。5、杂交前pcr扩增pre-pcr杂交体系如下：试剂体积(μl)dna15nuclease-freewater312×phusionhfpcrmastermix50p1primer(10μm自合成)2aprimer(10μm自合成)2totalvolume100将试剂完全转入一个新的pcr管中，按照如下程序进行pcr反应：反应后先加入0.9倍agencourtampurexp磁珠进行大片段选择，然后转移上清加入0.15倍agencourtampurexp磁珠进行纯化，用33μlnucleas-free水回溶，取上清后用qubit2.0质控并进行芯片杂交。6、目标区域捕获芯片杂交1)杂交体积计算：用qubit定量后将不同pcr产物等量混合(pooling)，共750ng。2)取750ngpooling产物转入一个新的离心管中，使用真空浓缩仪60℃约40min将产物蒸干。3)将所需的试剂置于冰上融化，充分混匀后轻微离心；4)在离心管中按照下表配制用于富集目的片段的样品文库体系；试剂体积(μl)pre-pcrlibrary750ngnuclease-freewater补水至2.8μlbgiblock#12.5bgiblock#22.5ionxpress_p1block(500μm)0.6ionxpress_a_xblock(500μm)0.6totalvolume95)将反应体系全部转入一个新的pcr管中，按照如下反应条件进行预杂交；温度时间95℃5min65℃holding6)在一个新的1.5ml离心管中按照下表配制杂交缓冲液反应体系；试剂体积(μl)hybridizationbuffer125hybridizationbuffer21hybridizationbuffer310hybridizationbuffer414totalvolume507)根据样品反应个数，按每个反应13μl的量分别加入到pcr管中，盖好管盖，然后将其放入pcr仪中65℃孵育至少5min，确认体系中没有晶体沉淀才能使用；8)在一个新的96孔pcr管中按照下表配制oligolibrarymix；试剂体积(μl)nuclease-freewater1.5rnaseblock0.5oligocapturelibrary5totalvolume7注意事项：此操作在冰上进行。9)将反应体系放入pcr仪中65℃孵育2min；10)保持各反应体系于65℃，揭开样品文库管和杂交buffer管的管盖，迅速把13μl的杂交buffer转移到样品文库管中；11)保持各反应体系于65℃，揭开96孔板上的oligolibrarymix管盖，迅速将样品文库管中的所有反应体系全部转移到oligolibrarymix管中，用移液器吹打混匀；12)保持pcr板于65℃，杂交24h。7、芯片洗脱及第二轮pcr扩增1)每一个杂交反应取50μldynabeadsm-280streptavidinbeads于一新的1.5ml离心管；2)将200μlbindingbuffer加入磁珠中，用漩涡混合仪剧烈振荡5s重悬磁珠；3)将离心管置于磁力架上2min，待液体完全澄清；小心吸取并弃去上清；4)重复步骤2)到步骤3)2次；5)加入200μlbindingbuffer重悬磁珠(重悬磁珠和杂交体系一起在垂直混匀仪上旋转混匀)；6)从pcr仪中直接将全部杂交混合液转移到准备好的磁珠中，上下颠倒离心管3到5次直到混匀；7)将装有杂交混合液和磁珠的离心管在垂直混匀仪上旋转混匀，室温下混匀30min；8)将样品从混匀装置取下，瞬时离心5s确保管盖上没有液体残留；9)将1.5ml离心管转移放置在磁力架上，静置3-5min待液体完全澄清，小心吸取并弃去上清；10)用500μlwashbuffer#1重悬磁珠，并于漩涡混合仪上振荡5s混匀样品，室温下孵育样品15min；11)将离心管瞬时离心3s，然后放置在磁力架上，静置3-5min待液体完全澄清，小心吸取并弃去上清；12)用500μlwashbuffer#2重悬磁珠，并于漩涡混合仪上振荡5s以混匀样品，将其置于thermomixer中65℃孵育10min；13)颠倒离心管以混匀样品，瞬时离心3s，然后将其放置在磁力架上，静置3-5min待液体完全澄清，小心吸取并弃去上清；14)重复步骤12)到步骤13)2次；15)用28μlnuclease-freewater重悬磁珠。16)在离心管中按照下表配制反应体系，充分混匀后轻微离心：试剂体积(μl)dna30nuclease-freewater162×phusionhfpcrmastermix50p1primer(10μm自合成)2aprimer(10μm自合成)2totalvolume10017)将试剂完全转入一个新的pcr管中，按照如下程序进行pcr反应：反应后加入1.5倍agencourtampurexpreagent，磁珠纯化后，使用52μlnuclease-freewater回溶，再次加入1.5倍agencourtampurexpreagent磁珠纯化，最后用33μlnuclease-freewater回溶，qubit2.0和安捷伦2100质控后上机测序。8、测序及结果分析。运用iontorrent公司的proton测序仪(lifetechnologies)对构建好的文库进行高通量测序。测序实验操作按照制造商提供的操作说明书操作。得到下机的数据后，对得到的测序结果进行数据过滤和质量控制，然后按照下列流程进行生物信息学分析：1)tmap：与reference序列比对，产生bam文件；2)bamduplicates：对pcr过程中生成的重复reads进行标记；3)qc：统计芯片的捕获效率、有效reads数、平均深度、重复率、覆盖度及未被覆盖的区间等信息；4)callsnp/indel：用tvc工具默认参数检测snp/indel变异；5)注释注释变异的功能、reads支持数、变异频率、氨基酸变异及cosmic中的变异等；本实例得到的下机数据结果如表4所示。表4实例测序下机数据结果样本测序数据量(bp)≥q20reads数量平均长度sc1465,768,497391,700,8613,102,543132bp数据质量结果如表5所示。表5实例测序结果数据质量分析样本sc1总有效数据量(mb)69.25目标区域捕获效率26.00％目标区域平均测序深度166.55目标区域覆盖度99.70％重复率81.61％同时，发明人在测序结果中验证了样本所携带的已知基因突变是否能被检测到，结果如表6所示。表6已知突变的检测结果样本阳性突变位点是否检出突变测序深度突变频率sc1tp53-i195f是16441％根据以上的数据分析结果，发明人得到以下结论：①根据表4的数据，此次测序的测序数据量、q20数据量、reads平均长度等指标均在正常范围内，说明此次测序结果数据可靠；②根据表5的数据，目标区域捕获效率均在26％左右，目标区域平均测序深度在166x左右，数值均在正常范围内，说明该芯片的捕获结果正常。同时，该芯片对于目标区域的覆盖度为99.7％，能较好地覆盖芯片设计的目标区域；③根据表6的结果，此次测试的ffpe样本所包含的已知突变成功被检测到，说明该芯片可以正确检测出样本中所包含的基因突变。综上所述，本发明所涉及的芯片在实例中实现了对样本dna目标区域的捕获以及样本所包含基因突变的检测。本发明可以应用于胃癌个体用药指导的研究之中。在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。当前第1页12MSA-2的相关资讯可以到我们网站了解一下，从专业角度出发为您解答相关问题，给您优质的服务！